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“髓减致痿”病机的实验研究

来源:中医中药秘方网 作者:www.21nx.com 发布时间:2017-02-02
骨质疏松症属于中医“骨痿” 范畴。中医理论 认为, 肾藏精主骨生髓, 精足则髓足, 骨骼得养则强 健有力; 精亏则髓减, 骨失其养则脆弱易折, 就会发 生 “骨痿” , 即骨质疏松症。本研究拟采用动物实 验, 从现代医学角度探讨中医“髓减致痿” 理论的科 学性, 并为中医 “肾主骨” 理论提供实验依据。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验动物 SPF 级雌性 SD 大鼠 60 只, 体质量( 210 ±10) g, 由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供 ( 许可证号 SCXK- ( 军) 2007- 004) , 饲养于中国中医科学院中医基础理论研 究所实验动物室( 实验动物使用许可证号 SYXK ( 京) 2010- 0032) 。 1. 1. 2 药物 左归丸药液组成: 熟地 24 g, 山 药 12 g, 山萸肉 12 g, 莬丝子12 g, 枸杞子12 g, 川牛 膝 9 g, 龟板胶 12 g, 鹿角胶 12 g。常规水煎减压浓 缩, 制备成浓度为 0. 968 g 生药/ml 的药液。戊酸 雌二醇: 拜耳医药保健有限公司广州分公司产品 ( 批号234A, 1 mg/片) 。临用时, 将戊酸雌二醇碾碎 后, 用纯净水制成浓度为 0. 0092 mg/ml 的混悬液。

1. 1. 3 主要试剂和仪器 主要试剂: 甲基丙烯 酸甲 酯 为 天 津 市 福 晨 化 学 试 剂 厂 产 品 ( 批 号 20130407) ; 甲基丙烯酸丁酯为国药集团化学试剂有 限公司产品( 批号 20120411) ; 苯甲酸甲酯为天津市 光复精细化工研究所产品( 批号 20100115) ; 聚乙二 醇 400 为国药集团化学试剂有限公司产品( 批号 20120714) ; 过氧化苯甲酰为国药集团化学试剂有限 公司产品( 批号 T20090409) ; N, N- 二甲基对甲苯胺 为 ALDRICH 公司产品( 批号 04327MB- 235) 。 主 要 仪 器: Skyscan1174 Micro- CT ( 比 利 时, Bruker 公司) ; Reicheit- Jung2040 切片机( 德国, Leica 公司) ; DM 6000B 正置显微镜( 德国, Leica 公司) ; Qwin Pro V3. 5. 0 图像分析系统( 德国, Leica 公司) 。

1. 2 方法

1. 2. 1 动物分组及处理 将 60 只 SD 雌性大 鼠以体质量按随机数字表法分为空白对照组12 只, 假手术组 12 只, 造模组 36 只。造模组大鼠按照文 献 [1 ] 方法切除大鼠双侧卵巢, 假手术组仅摘除卵巢 附近的部分脂肪组织但不摘除卵巢。术后 10 d, 再 将造模组 36 只大鼠以体质量按随机数字表法分为 模型组、 阳性对照组及补肾组各 12 只。然后开始灌 胃给药, 补肾组灌胃给予 0. 968 g 生药/ml 的左归丸 药液, 给药体积为 1 ml/100 g 体质量, 给药剂量为 9. 68 g 生药/kg 体质量; 阳性对照组给予 0. 0092 mg/ml 的戊酸雌二醇混悬液, 给药体积为1 ml/100 g 体质量, 给药剂量为 0. 092 mg/kg。每天灌胃 1 次, 连续 6 d, 休息 1 d 再给药 6 d, 如此连续给药 3 个 月。每周称重 1 次, 据此调整给药量。空白对照组、 假手术组和模型组按上法给予等体积的纯净水。 末次 给 药 后,将 各 组 大 鼠 用 戊 巴 比 妥 钠 ( 45 mg/kg体质量) 腹腔注射麻醉, 然后迅速处死。 取右侧胫骨及股骨 4% 多聚甲醛固定, 分别用于不 脱钙骨切片制作和 Micro CT 检测。

1. 2. 2 指标检测方法 ( 1) Micro CT 检测。 采用 Micro- CT 对各组大鼠的股骨进行扫描。将大 鼠右侧股骨从固定液中取出后置于生理盐水中浸 泡, 为防止扫描过程中样本出现脱水和移位, 扫描时 将股骨用浸有生理盐水的湿纸巾包绕后放到样本管 中, 固定在 Micro CT 载物台上。电压 50 kV, 电流 800 μA, 以180°扫描角度、 12 μm 扫描分辨率、 1304 × 1024 视野大小沿股骨长轴方向对股骨远端进行扫 描。将生长板下 1mm 定为扫描参考线, 扫描参考线 以下 1. 5 mm 的区域设定为三维重建兴趣区域 ( range of interests ROI) , 用 N- Recon 软件进行骨小 梁三维图像重建, 用 CT- AN 软件进行三维分析, 获 得骨体积分数 BV/TV( %) , 即所选区域内骨小梁总 体积与样本总体积之比; ( 2) 骨组织形态计量学指 标检测。取右侧胫骨近端 1/3 去除软组织, 乙醇逐 级脱水, 二甲苯透明, 塑料包埋。在 Reicheit- Jung 2040 切片机上, 用钨钢刀分别切出 5 μm 的纵向不 脱钙骨切片, 甲苯胺蓝染色。 参照文献 [2 ] 所述方法, 采用 Qwin Pro V3. 5. 0 图像分析系统, 对不脱钙骨切片的以下指标进行计 量: ① 骨小梁体积百分比( TBV%) : 骨小梁体积占 被测骨髓腔总体积的百分比是衡量骨量水平的主要 标志; ②骨小梁吸收表面百分比( TRS%) : 凹凸不 平、 不规则的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比: ③骨小梁形成表面百分比( TFS%) : 有成骨细胞被 覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比。骨丢失率 ( %) = ( 每只大鼠的 TBV% 值 - 空白对照组大鼠 TBV%平均值) /空白对照组大鼠 TBV% 平均值 × 100%。骨丢失率为正值时表示骨量增加, 绝对值越 大表示骨量增加越多; 为负值时, 表示骨量丢失, 绝 对值越大表示骨量丢失越多 [3 ] 。骨髓腔内脂肪细 胞体积百分比( ABS%) : 骨髓腔内脂肪细胞的面积 占被测骨髓腔面积的百分比。

1. 3 统计学方法

采用 SPSS 20. 0 统计软件进行统计分析, 实验 结果以均数 ± 标准差( 珋 x ± s) 表示, 正态分布采用单 因素方差分析, 非正态分布数据采用 Kruskal- Wallis 1- way ANOVA( k samples) 检验。

2 结果

2. 1 各组大鼠股骨 BV/TV 的变化

表 1 图 1 比较, 与假手术组比较, 模型组、 补肾 组和阳性对照组大鼠股骨的 BV/TV 显著减少; 与模 型组比较, 补肾组和阳性对照组大鼠股骨的 BV/TV 值显著增加。

表 1 各组大鼠股骨 BV/TV 变化比较[例( %) ]

组 别 例数 BV/TV

空 白 对 照 组 12 17. 15 ±2. 06

假 手 术 组 12 16. 54 ±2. 27

模 型 组 12 8. 12 ±1. 69 **

阳 性 对 照 组 12 12. 31 ±2. 05 * ##

补 肾 组 12 11. 01 ±2. 33 **#

注: 与假手术组比较: * P <0. 05, ** P <0. 01; 与模型组比较: # P < 0. 05, ## P <0. 01

2. 2 各组大鼠胫骨 TBV%及骨丢失率的变化

表 2 显示, 模型组、 补肾组和阳性对照组大鼠胫骨的 TBV%显著低于假手术组; 而补肾组和阳性对 照组的 TBV%显著高于模型组。与假手术组比较, 模型组、 补肾组和阳性对照组大鼠胫骨的骨丢失率 ( 绝对值) 显著增加; 而与模型组比较, 补肾组和阳 性对照组的骨丢失率( 绝对值) 显著减少。

表 2 各组大鼠胫骨 TBV%及骨丢失率的变化

组 别 例数 TBV% 骨丢失率( %)

空 白 对 照 组 12 31. 63 ±3. 61 —

假 手 术 组 12 30. 64 ±4. 25 -3. 42 ± 6. 46

模 型 组 12 16. 43 ±3. 29 * * -48. 05 ±10. 41 **

阳 性 对 照 组 12 24. 12 ±2. 94 * * ## -23. 79 ± 9. 30 **##

补 肾 组 12 21. 31 ±3. 09 * ## -32. 65 ± 9. 77 **##

注: 与假手术组比较: * P <0. 05, ** P <0. 01; 与模型组比较: # P < 0. 05, ## P <0. 01

2. 3 各组大鼠胫骨 TRS%、 TFS% 及 TRS/TFS 的变化

模型组、 补肾组和阳性对照组与假手术组比较, 大鼠胫骨 TRS%、 TFS%和 TRS/TFS 均显著增加; 而 与模型组比较, 补肾组和阳性对照组的 3 个指标均 显著减少。

表 3 各组大鼠胫骨 TRS%、 TFS%及 TRS/TFS 的变化

组 别 例数 TRS% TFS% TRS/TFS

空白对照组 12 2. 38 ±0. 55 4. 78 ±0. 68 0. 51 ±0. 14

假 手 术 组 12 2. 32 ±0. 74 4. 52 ±0. 53 0. 52 ±0. 17 模 型 组 12 9. 29 ±2. 39 ** 7. 76 ±0. 72 ** 1. 22 ±0. 39 **

阳性对照组 12 4. 04 ±1. 33 **## 5. 61 ±0. 94 * ## 0. 74 ±0. 27 * ## 补 肾 组 12 5. 04 ±1. 06 **## 6. 39 ±0. 75 **## 0. 80 ±0. 19 **##

注:与假手术组比较: * P < 0. 05, ** P < 0. 01; 与模型组比较: # P < 0. 05, ## P <0. 01

2. 4 各组大鼠骨髓腔中脂肪细胞变化

2. 4. 1 光镜下观察 图 2 显示, 模型组大鼠胫 骨骨小梁较空白对照组和假手术组显著减少, 其排 列稀疏, 间距加宽, 小梁之间连接差。髓腔中的脂肪 细胞呈圆形或类圆形的空泡状, 模型组中的脂肪细 胞较空白对照组和假手术组显著增多, 而其他骨髓 细胞相对减少。补肾组和阳性对照组的骨小梁较模 型组明显增多, 而脂肪细胞明显减少, 其他骨髓细胞 相对增多。

2. 4. 2 各组大鼠胫骨骨髓腔中 ABS%的变化 表 4 显示, 与假手术组比较, 模型组、 阳性对照 图 2 各组大鼠胫骨骨髓腔中脂肪细胞分布情况 注: a: 空白对照组; b: 假手术组; c: 模型组; d: 阳性对照组 e: 补肾组; 箭头所指的白色部分是骨髓腔中的脂肪细胞 组和补肾组大鼠胫骨骨髓腔中 ABS% 显著增加; 与 模型组比较, 补肾组和阳性对照组 ABS%显著减少。

表 4 各组大鼠胫骨骨髓腔内 ABS%的变化

组 别 例数 ABS%

空 白 对 照 组 12 3. 73 ±1. 01

假 手 术 组 12 3. 52 ±0. 83

模 型 组 12 16. 63 ±2. 93 **

阳 性 对 照 组 12 10. 15 ±2. 24 **##

补 肾 组 12 9. 46 ±2. 47 **##

注: 与假手术组比较: * P <0. 05, ** P <0. 01; 与模型组比较: # P < 0. 05, ## P <0. 01

与空白对照组比较, 假手术组的上述指标均未 发生明显改变, 从而排除了手术因素对实验的影响。

3 讨论

骨质疏松症属于中医“骨痿” 范畴 [4 ] 。“骨痿” 之名首见于《黄帝内经》 。《素问·痿论》 云 : “肾气 热, 则腰脊不举, 骨枯而髓减, 发为骨痿” ; “肾者水 脏也, 今水不胜火, 则骨枯而髓虚, 故足不任身, 发为 骨痿。 ” 明确指出 “髓减 ” “髓虚” 是导致“骨痿” 的重 要原因。中医理论认为, 肾藏精主骨生髓。如《素 问 · 六节脏象论》 : “肾者, 主蛰, 封藏之本, 精之处 也……其充在骨 ” ; 《素问 · 阴阳应象大论》 : “肾生骨 髓 ” ; 《素问 · 痿论 》 : “肾主身之骨髓” , 都将肾- 精- 髓- 骨的生理功能紧密结合在一起。正如《中西汇通医 经精义》 所言 : “肾藏精, 精生髓, 髓生骨, 故骨者肾 之合也。髓者, 肾精所生, 精足则髓足, 髓在骨内, 髓 足则骨强。 ” 由此可见, 肾实精足则骨髓生化有源, 骨髓充足骨得以充分滋养而坚固有力; 若肾虚精少、 骨髓化生乏源、 骨髓减少、 骨乏其养就会导致骨 痿 [5 ] 。综上所述 , “髓减” 是“骨痿” 发生的基本病 机, 所以历代医家治疗骨质疏松症多从补肾入手, 将 “补肾益精生髓” 作为治疗该病的基本大法。 本研究结果显示, 大鼠切除卵巢后骨丢失显著 增加, BV/TV 以及 TBV% 显著减少; 而代表骨吸收 指标的 TRS% 和 TRS/TFS 以及代表骨形成指标的 TFS%均显著增高, 说明卵巢切除所造成的是一种 骨吸收和骨形成均增高, 但由于骨吸收大于骨形成, 进而导致骨量丢失的高转换型骨质疏松症。病理观察显示, 模型组大鼠胫骨骨小梁较假手术组显著减 少, 其排列稀疏、 间距加宽发生“骨痿” 。同时, 髓腔 中的脂肪细胞较假手术组显著增多, 而其他骨髓细 胞相对减少。形态计量结果进一步显示, 模型组 TBV%显著减少的同时, 其 ABS% 显著增高。脂肪 细胞的显著增多, 导致其他骨髓细胞明显减少, 即出 现了 “髓减” 。这一结果说明 , “髓减” 与“骨痿” 之 间存在着密切联系。而采用左归丸补肾后, 在骨小 梁明显增多的同时, 髓腔中 ABS%明显下降, 即髓腔 中的脂肪细胞明显减少, 而骨髓细胞明显增多, 从而 进一步证明中医 “髓减致痿” 病机的正确性, 同时也 说明 “肾主骨” 理论的科学性。

现代研究表明, 大鼠脂肪基质干细胞( adipose tissue - derived mesenchymal stem cells,ADSCs) 具有 多向分化潜能, 在体外经诱导剂诱导后显示出较强 的成骨分化能力。雌二醇可促进 ADSCs 的增殖, 并 能提高其向成骨细胞分化的能力 [6- 8 ] 。本实验结果 显示, 去卵巢大鼠补充雌二醇后骨髓中的脂肪细胞 明显减少, 而其他骨髓细胞明显增多, 从而说明雌激 素在诱导脂肪基质干细胞向其他骨髓细胞的转化过 程中起重要作用, 给予去卵巢大鼠左归丸后也产生 了同样的结果。据此推测, 补肾可能有促进脂肪基 质干细胞向成骨细胞分化的能力, 进而使脂肪细胞 明显减少, 而使其他骨髓细胞相应增加, 即通过“增 髓” 而达到治疗“骨痿” 的作用, 对此还有待进一步 的深入研究。

参考文献:

[1] 鞠大宏,张丽坤,赵红艳,等. 滋阴补肾法对卵巢切除所致 骨质疏松大鼠骨髓基质细胞 IL- 1 和成骨细胞 IL- 6 表达的影 响[J]. 中国中医基础医学杂志, 2005, 11( 7) :495- 498.

[2] 章明放,张乃鑫,谭郁彬. 运动对雌性大鼠去势后骨质疏松 症的作用[J]. 中华骨科杂志, 1994, 14( 6) :365- 369.

[3] 付小卫,宋长恒,张治国,等. 从 OPG- RANKL 破骨细胞调 控通路和 Wnt 成骨细胞调控通路探讨 “肾主骨” 的性别差异 及其机制[J]. 中国中医基础医学杂志,2016,22( 1) : 66- 72.

[4] 辛小玲,李兆弟,于峥,等. 骨痿的病因病机[J]. 中国中医 基础医学杂志, 2012, 18( 5) :470.

[5] 赵红霞,于智敏,鞠大宏,等. 骨质疏松症的中医证候病机 研究[J]. 中国中医基础医学杂志, 2008, 14( 10) :723- 724.

[6] 陈昕,丁寅,蔡川,等. 雌激素对老年大鼠脂肪干细胞体外 诱导成骨能力的影响[J]. 口腔医学研究,2010,26( 3) : 340- 342.
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